Gazzetta Ufficiale n.
296
MINISTERO DELLA
SANITA'
DECRETO 14
ottobre 1998.
Modificazioni all'allegato al decreto
legislativo 30 dicembre 1992,
n. 530, e successive modifiche, in attuazione
della direttiva
97/61/CE.
IL
MINISTRO DELLA SANITA'
Visto il decreto legislativo 30 dicembre 1992,
numero 530
concernente attuazione della direttiva 91 492 CEE, che stabilisce
norme sanitarie applicabi alla produzione e commercializzazione dei
molluschi bivalvi vivi;
Vista la legge 20 novembre 1995, n. 490, recante
conversione in
legge, con modificazioni, del decreto-legge 20 settembre
1995, n.
390, concernente provvedimenti urgenti in materia di prezzi di
specialita' medicinali, nonche' in materia sanitaria;
Visto il decreto
legislativo 15 marzo 1996, n. 249, recante
modificazioni al decreto
legislativo 30 dicembre 1992, n. 530,
concernente attuazione della direttiva
91 492 CEE che stabilisce
norme sanitarie applicabili alla produzione e
commercializzazione dei
molluschi bivalvi vivi;
Vista la direttiva 97 61
CE del 20 ottobre 1997, che modifica
l'allegato alla direttiva 91 492 CEE,
che stabilisce norme sanitarie
applicabili alla produzione e
commercializzazione dei molluschi
bivalvi vivi;
Visto il decreto del
Ministero della sanita' 31 luglio 1995
concernente metodiche di analisi per
la determinazione dei coliformi
fecali, di Escherichia coli, delle
salmonelle, delle biotossine PSP
(Paralytic Shellfish Poison), delle tossine
DSP (Diarrhetic Shellfish
Poison), del mercurio e del piombo nei molluschi
bivalvi (pubblicato
nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n.
279, del 29
novembre 1995);
Vista la decisione del Consiglio 93/383/CEE
del 14 luglio 1993 in
materia di laboratori di riferimento per il
monitoraggio delle
biotossine marine;
Considerato che la direttiva 97 61
CEE apporta modifiche tecniche
alla direttiva 91 492 CEE;
Visto l'art.
17
Visto l'art. 20 della legge 16 aprile 1987, n. 183,
concernente il
coordinamento delle politiche riguardanti l'appartenenza
dell'Italia
alle Comunita' europee e l'adeguamento dell'ordinamento interno
agli
atti normativi comunitari;
Decreta:
Art. 1.
1. All'allegato del decreto
legislativo 30 dicembre 1992, n. 530,
sono apportate le seguenti
modificazioni:
a) il testo del punto 6 del capitolo II e' sostituito dal
seguente:
"6. Un documento di registrazione per identificare i lotti di
molluschi bivalvi vivi deve accompagnare ogni lotto durante il
trasporto
dalla zona di produzione al centro di spedizione, al centro
di depurazione,
alla zona di stabulazione o allo stabilimento di
trasformazione. Il
documento e' rilasciato dall'autorita' competente
su richiesta
lotto, in caratteri leggibili e indelebili, le sezioni
pertinenti del
documento di registrazione, in cui devono essere riportate le
seguenti indicazioni:
a) identita' e indirizzo del produttore;
b)
data di raccolta;
c) ubicazione della zona di produzione, definita in
maniera
circostanziata, oppure con un numero di codice;
d) status
sanitario della zona di produzione come previsto al
capitolo I;
e)
precisa indicazione della specie di molluschi bivalvi vivi e
della relativa
quantita';
f) numero di riconoscimento e luogo di destinazione per il
confezionamento, la stabulazione, la depurazione o la trasformazione.
Il
documento di registrazione deve essere datato e firmato dal
produttore.
I documenti di registrazione devono essere numerati in maniera
continua
e in ordine di successione. L'autorita' competente tiene un
registro in cui
figurano il numero dei documenti di registrazione e
il nome delle persone
che raccolgono i molluschi bivalvi vivi a cui
sono stati rilasciati. Il
documento di registrazione deve riportare
la data di consegna dello stesso
al centro di spedizione, al centro
di depurazione, alla zona di stabulazione
o allo stabilimento di
trasformazione e deve essere conservato dai
responsabili dei suddetti
centri, zone o stabilimenti per almeno dodici
mesi. Il produttore e'
ugualmente tenuto a conservare il documento per lo
stesso periodo di
tempo. Tuttavia se la raccolta e' effettuata da addetti
spedizione,
dello stabilimento di trasformazione di destinazione,
il documento di
registrazione puo' essere sostituito da un'autorizzazione
permanente
di trasporto rilasciata dall'autorita' competente. Un modello
standardizzato del documento di registrazione, contenente un
riferimento
ai vari requisiti che devono figurarvi e menzionati ai
capitolo II, III e IV
del presente allegato, sara' stabilito con
decreto del Ministro della
sanita' in conformita' a decisioni
comunitarie";
b) il testo del punto 9
del capitolo III e' sostituito dal
seguente:
"9. Durante il trasporto
dalla zona di stabulazione, dove sono
stati raccolti, al centro di
spedizione, al centro di depurazione,
allo stabilimento di trasformazione
riconosciuti, i lotti devono
essere accompagnati da un documento di
registrazione contenente in
particolare, oltre alle indicazioni previste al
Capitolo II, punto 6
del presente allegato, l'ubicazione e il numero di
riconoscimento
della zona di stabulazione e l'indicazione della durata della
stabulazione effettuata, nonche' qualsiasi altra indicazione
necessaria
per l'identificazione e la rintracciabilita' del prodotto.
Tale requisito
non e' necessario nel caso in cui, sia nella zona di
stabulazione che nel
centro di spedizione, nel centro di depurazione
o nello stabilimento di
trasformazione, operino gli stessi addetti";
c) il testo del secondo comma
del punto 13 della sezione III del
capitolo IV e' sostituito dal seguente:
"I centri di depurazione che inviano lotti di molluschi bivalvi
vivi a
centri di spedizione devono fornire un documento di
registrazione contenente
in particolare, oltre alle indicazioni
previste al Capitolo II, punto 6 del
presente allegato, il numero di
riconoscimento e l'indirizzo del centro di
depurazione e
l'indicazione della durata del processo di depurazione
effettuata, le
date di ingresso e uscita dal centro di depurazione nonche'
qualsiasi
altra indicazione necessaria per l'identificazione e la
rintracciabilita' del prodotto".
d) il testo del punto 4 della sezione
IV del capitolo IV e'
sostituito dal seguente;
"I centri di spedizione
devono tenere a disposizione dell'autorita'
competente i seguenti dati:
a) i risultati degli esami microbiologici dei molluschi bivalvi
vivi
provenienti da una zona di produzione riconosciuta o da una zona
di
stabulazione o da un centro di depurazione:
b) la data e la quantita' di
molluschi bivalvi vivi consegnati al
centro di spedizione e i documenti di
registrazione pertinenti;
c) dati particolareggiati sulle spedizioni,
inclusi i nomi e gli
indirizzi dei destinatari, la data e la quantita' di
molluschi
bivalvi vivi spediti e il/i numero/i del/i documento/i di
registrazione d'ingresso corrispondente/i alle spedizioni di
molluschi.
Tali dati devono essere classificati cronologicamente e archiviati
per
un periodo di almeno dodici mesi, che dovra' essere precisato
dall'autorita'
competente".
e) al capitolo V e' aggiunto il seguente punto;
"7-bis) il
tenore di ''Amnesic Shellfish Poisoning'' (ASP) nelle
parti commestibili dei
molluschi (corpo intero o parti commestibili
separatamente) non deve
superare i 20 microgrammi di acido domoico
per grammo secondo il metodo di
analisi HPLC".
Art. 2.
1. Ai fini della determinazione delle biotossine algali ASP e'
approvato il metodo di analisi riportato in allegato.
Art. 3.
1. Il laboratorio
nazionale di riferimento per il monitoraggio
delle biotossine marine e' il
Centro ricerche marine, viale A.
Vespucci 2 - Cesenatico
(
2. Il presente decreto
e' trasmesso alla Corte dei conti per la
registrazione ed entra in vigore il
giorno dopo la sua pubblicazione
nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana.
Roma, 14 ottobre 1998
Il Ministro: Bindi
Registrato alla
Corte dei conti il 23 novembre 1998
Registro n. 2 Sanita', foglio n. 105
ALLEGATO
METODO PER
L'IDENTIFICAZIONE E LA DETERMINAZIONE DELL'ACIDO
DOMOICO NEI MOLLUSCHI EDULI
LAMELLIBRANCIII
1. Scopo e
campo di applicazione
Il metodo descritto permette l'identificazione e
la determinazione
dell'acido domoico nei molluschi eduli lamellibranchi. Il
limite di
rivelazione
tessuto edibile.
2. Principio
L'acido domoico e' estratto
dalla polpa dei molluschi con soluzione
metanolo: acqua, 1 : 1 (v : v), e,
dopo ultrafiltrazione, e'
determinato mediante cromatografia liquida ad alta
risoluzione (HPLC)
su colonna C18 con rivelazione spettrofotometrica UV,
alla lunghezza
d'onda di 242 nm.
3. Reagenti
3.1 Tutti i reagenti
impiegati devono essere di qualita' analitica.
3.2 L'acqua usata deve essere
bidistillata.
3.3 Acetonitrile.
3.4 Acido domoico.
3.5 Metanolo.
3.6 Acido trifluoroacetico (TFA) per spettroscopia.
4. Apparecchiature
4.1 Vetreria di
laboratorio.
4.2 Bilancia tecnica.
4.3 Bilancia analitica.
4.4
Omogeneizatore a lame rotanti.
4.5 Omogeneizatore ad immersione.
4.6
Centrifuga.
4.7 Unita' filtro di tipo Millipore Ultrafree-MC, membrana PLGC,
a
basso assorbimento, da 10.000 NMWL, o unita' filtro equivalenti.
4.8
Sistema per degassaggio eluenti.
4.9 Pompa per HPLC.
4.10 Valvola
d'iniezione con loop fisso.
4.11 -Sistema di termostatazione colonne.
4.12 Pre-colonna-per HPLC impaccata con 5 micron m di ODS.
4.13 Colonna
analitica per HPLC (250 x 4.6 mm), impaccata con 5
micron m di ODS,
termostatata a 40› C (4.11).
4.14 Rivelatore spettrofotometrico UV.
4.15
Sistema per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati.
5. Soluzioni
5.1 Soluzione
acetonitrile : acqua, 10 : 90 (v : v).
5.2 Soluzione concentrata di acido
domoico (100 micron g/mL).
Pesare 0,5 mg di acido domoico (3.4) e
disciogliere in 5,0 mL di
soluzione acetonitrile : acqua, 10 : 90 (v : v)
(5.1).
5.3 Soluzioni di riferimento. Diluire la soluzione concentrata di
acido domoico (5.2) con soluzione acetonitrile : acqua, 10 : 90 (v :
v)
(5.1) in modo da ottenere soluzioni di concentrazioni di 0,4
micron g/mL,
2,0 micron g/mL, 4,0 micron g/mL e 8,0 micron g/mL di
acido domoico.
5.4
Soluzione estraente di acqua : metanolo, 1 : 1 (v : v).
5.5 Fase mobile.
Miscelare 100 mL acetonitrile (3.3) con 400 mL di
acqua (3.2); aggiungere
0,2 mL TFA (3.6), e portare a volume con
acqua (3.2) in matraccio tarato da
1000 mL Assicurare il degassaggio
della fase mobile.
6. Procedimento
6.1 Preparazione
del campioni
6.1.1 Pulire esternamente, lavandoli con acqua, i molluschi da
analizzare.
6.1.2 Aprire i molluschi tagliando i muscoli adduttori e
rimuovere i
tessuti molli (polpa)
usare ne' calore, ne' anestetici prima di aprire il mollusco e nel
corso dell'operazione bisogna evitare di danneggiare o tagliare il
corpo.
6.1.3 Prelevare un campione di ca. 100 9 di polpa (6.1.2) e
trasferirlo su una retina di plastica, lasciando scolare per 5
minuti.
6.1.4 Omogeneizare il campione (6.1.3) con omogeneizzatore a lame
rotanti (4.4).
Conservare la polpa residua (6.1.3) a temperatura <=
-10 ›C.
6.2 Estrazione
6.2.1 Pesare accuratamente un'aliquota di 4 9 di
campione
omogeneizzato (6.1.4) e trasferirla in un tubo da centrifuga
graduato.
6.2.2 Aggiungere all'omogeneizzato (6.2.1) 16,0 mL di
soluzione
estraente (5.4) ed estrarre con omogeneizatore ad immersione (4.5)
per 3 min a 10.000 rpm.:
6.2.3 Centrifugare (4.6) l'estratto (6.2.2) a
3000 rpm per 10 min.
6.3 Ultrafiltrazione
6.3.1 Prelevare dalla fase
liquida (6.2.3) un'aliquota di 0,1 mL e
trasferirla nell'unita' di
ultrafiltrazione (4.7).
6.3.2 Ultrafiltrare centrifugando per 30 minuti a
9000 rpm.
Note: Analizare l'estratto filtrato (6.3.2) in un breve
intervallo
di tempo.
Conservare gli estratti residui (6.3.1) a
temperatura <= -10 ›C.
6.4 Determinazione HPLC-UV
6.4.1 Condizioni
cromatografiche
- separazione mediante eluizione isocratica, a 40 ›C (4.11);
- fase mobile: (5.5);
- flusso: 1 mL/min;
- volume iniettato 20
micron L;
- rivelazione spettrofotometrica a 242 nm.
6.4.2 Costnuzione
della curva di taratura.
Iniettare le soluzioni di riferimento (5.3);
costruire una curva di taratura di tipo y = ax + b,
dove: y = area del
picco dell'acido domoico; x = concentrazione
della soluzione di riferimento
(5.3) in micron g/mL; a = coefficiente
angolare; b = intercetta sull'asse
delle y.
6.4.3 Analisi dei campioni per la ricerca di acido domoico:
iniettare 20 micron L di estratto filtrato (6.3.2) per la
determinazione
HPLC-UV.
Nota: Eseguire prima di ogni serie analitica la determinazione
del
"bianco- reagente", applicando l'intero metodo di analisi omettendo
la porzione di campione per l'analisi. Nel cromatogramma del
bianco-reagente non dovrebbero essere presenti picchi interferenti
con
l'acido domoico, oppure presenti a livelli trascurabili.
7. Identificazione;
7.1
L'identificazione dell'acido domoico si ottiene per confronto
ritenzione
7.2 Per informazioni supplementari ricorrere alla co-cromatografia.
7.2.1 Ripartire l'estratto (6.3.2) in 2 aliquote:
a) su un aliquota
effettuare direttamente la determinazione HPLC-UV
(6.4);
b) addizionare
all'altra aliquota un volume trascurabile di
soluzione standard di acido
domoico (5.2 o 5.3) in modo tale da
ottenere una concentrazione finale di
acido domoico nell'estratto
pari a circa il doppio della conceratrazione che
si ritiene presente
nell'estratto in esame.
7.2.2 L'identificazione del
picco dell'acido domoico nell'aliquota
(7.2.1.b) e' basata sulla presenza di
un picco, la cui area
incrementa rispetto all'area
(7.2.1, a) in modo proporzionale alla quantita' di analita
addizionato. La larghezza del picco (7.2.1, b), misurata a meta'
altezza, deve essere 90-110 % della larghezza ottenuta per il picco
dell'estratto non addizionato (7.2.1, a) ed il tempo di ritenzione
deve
coincidere con quello del picco ottenuto per l'estratto non
addizionato
(7.2.1, a).
8. Determinazione
8.1 La determinazione quantitativa e' realizzata mediante
interpolazione dell'area
campione sulla curva di taratura (6.4 2).
8.2 Per campioni
ad elevate concentrazioni di acido domoico e'
opportuno procedere a
diluizioni dell'estratto filtrato (6.3.2):
prima della determinazione
cromatografica, al fine di ottenere una
concentrazione di analita compresa
nell'intervallo di linearita'
verificato (6.4.2).
8.3 Espressione dei
risultati
La concentrazione C di acido domoico, espressa in 1l9 di acido
domoico per g di polpa, e' calcolata secondo la seguente equazione:
y-b
100 V
C --- x --- x --- x D
= a Rm m
dove:
y = Area del picco di
acido domoico dell'estratto campione (6.4.3).
b = Intercetta della curva
(6.4.2) sull'asse delle y.
a = Coeffficiente angolare della curva di
taratura (6.4.2).
Rm = Recupero medio (%), calcolato come al punto 9.2.9.
V = Volume finale dell'estratto (6.2.2).
m = Massa in g dell'aliquota di
campione (6.2.1).
D = Fattore di diluizione (se e' stata operata una
diluizione
dell'estratto) (8.2).
9. Valutazione
9.1 Limite di rivelazione.
Il limite di rivelazione del metodo, calcolato con un S/N = 5 : 1,
e'
pari a 0,2 micron g di acido domoico per g di polpa.
9.2 Calcolo del
recupero
9.2.1 Valutare il recupero del metodo effettuando prove di recupero
su "bianco-campione" di molluschi per il quale attraverso precedenti
determinazioni cromatografiche sia stata dimostrata l'assenza del
picco
dell'acido domoico o di picchi interferenti nell'intorno del
tempo di
ritenzione dell'acido domoico.
9.2.2 Preparare il bianco-campione come
descritto in 6.1 fino ad
ottenere un omogeneizzato di bianco-campione.
9.2.3 Suddividere il bianco-campione omogeneizzato (9.2.2) in un
numero
di aliquote corrispondenti ai livelli di fortificazione, piu'
un'aliquota
per la prova in bianco.
9.2.4 Fortificare le aliquote (9.2.3)1 ad eccezione
dell'aliquota
destinata alla prova in bianco, con ridotti volumi di
soluzione
concentrata di acido domoico (5.2) in modo da ottenere in ogni
aliquota una diversa concentrazione di acido domoico (livello di
fortificazione). I livelli di firtificazione devono essere almeno 2.
9.2.5 Procedere con l'estrazione e l'analisi dei campioni
fortificati e
della prova in bianco come descritto in 6.2 - 6.4.
9.2.6 Verificare
l'assenza di picchi nell'intorno tempo di
ritenzione dell'acido domoico
nella prova in bianco.
9.2.7 Calcolare il recupero in percentuale (R), sui
campioni
fortificati, come segue:
y-b 100 V
R --- x --- x ---
=
a Cf m
dove:
y = Area del picco di acido domoico dell'estratto campione
(6.4.3).
b = Intercetta della curva (6.4.2) sull'asse delle y.
a =
Coefficiente angolare della curva di taratura (6.4.2).
Cf = Concentrazione
teorica di acido domoico nell'aliquota
di campione fortificato (9.2.4).
V = Volume finale dell'estratto (6.2.2).
m =
9.2.8 Eseguire le prove di recupero, per ciascun livello di
fortificazione, in triplicato, per due giorni consecutivi (n >= 12).
9.2.9 Stima dell'accuratezzab precisione.
Analizzare statisticamente i
valori di recupero (9.2.7) ottenuti
nelle diverse prove (9.2.8) per ottenere
il recupero medio (Rm) e la
deviazione standard
Nota: Valori
indicativi di recupero medio (%) per i livelli di
fortificazione di 2 e 20
micron g/g sono rispettivamente di 91,9 +=
6,2 e 96,3 += 3,8 con un valore
medio di 94,3 += 5,3..
10.
Sicurezza
L'acido domoico e' una neurotossina e deve essere maneggiata
con
cautela.
Acetonitrile e metanolo sono solventi tossici e volatili.
L'acido trifluoroacetico e' tossico, volatile e corrosivo e deve
essere
maneggiato sotto cappa.
Tutte queste sostanze sono nocive se ingerite,
inalate o assorbite
per via cutanea.
11. - Riferimenti
Quilliam, M. A.,
Xie, M., and Hardstoff, W. R. (1995) J. AOAC Int.
78, 543-554.